荧光分光光度计定量分析时多采用工作曲线法，即以已知量的标准物质，按试样相同方法处理后，配成一系列标准溶液，测定其相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度，扣除空白值后，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线。
然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其相对荧光强度，扣除空白值后，从工作曲线上求出荧光物质的含量。
在荧光分光光度计用荧光分析法测定某些会引起荧光改变的微量物质时，常采用差示荧光法，可使荧光强度的读数差距拉大，使荧光强度的降低加大，从而提高方法的灵敏度和准确度。
在使用时需要注意开机次序，光度计开机顺序一般为先开氙灯，然后开仪器主机，接着开跟仪器连接的计算机。如此操作的原因在于稳态氙灯是高压点亮，为了避免瞬问脉冲电流对周围设备造成影响，需要先开氙灯，等电流稳定后再打开周边的电脑等设备。关机顺序则相反。
荧光分光光度计使用注意事项：
1、样品应盛在四面透光的石英比色皿（荧光池）中，如果是挥发性样品应使用带塞的荧光池。
2、在使用仪器进行荧光分析时，为了得到稳定可靠的数据，一般需要开机预热氙灯大约30分钟。如果仪器光源采用的是闪烁氙灯，预热时间可以缩短到10分钟左右。对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长、低人射光强度及短时间光照。
3、温度变化可引起仪器荧光强度的改变。通常降低温度，有利于提高荧光量子产率，荧光强度增大。温度影响荧光强度的明显程度因样品而异，大部分荧光物质的荧光强度受温度影响不大，测试温度变化不超过±3℃，对测试结果几乎无影响。
4、当仪器的荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。
5、荧光分光光度计的荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低，常见的荧光猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、02、硝基化物质、重氮化合物等。
溶液中的溶解氧也能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象，因此在较严格的荧光实验中必须除氧。
